固態納米孔：下一代DNA測序技術原理、工藝與挑戰編輯推薦： 相比傳統的測序技術,固態納米孔測序技術在成本、速度等方面有著十分巨大的優勢. 然而,作為一種新興的測序技術,固態納米孔在制造、測序、集成
編輯推薦：
相比傳統的測序技術, 固態納米孔測序技術在成本、速度等方面有著十分巨大的優勢. 然而, 作為一種新興的測序技術, 固態納米孔在制造、測序、集成等方面也存在著諸多挑戰.來自中科院的學者就這一方面發表了綜述，主要介紹了納米孔測序技術的原理、制備工藝和面臨的挑戰, 并展望了未來納米孔測序技術的發展前景。 固態納米孔測序技術作為新興的第四代 DNA測序技術, 具有低成本、高讀長、易集成等優勢. 如今, 隨著半導體工藝技術的飛速發展, 小型化、高速度、大通量的納米孔測序芯片的實現成為可能. 相比傳統的測序技術, 固態納米孔測序技術在成本、速度等方面有著十分巨大的優勢. 然而, 作為一種新興的測序技術, 固態納米孔在制造、測序、集成等方面也存在著諸多挑戰.來自中科院的學者就這一方面發表了綜述，主要介紹了納米孔測序技術的原理、制備工藝和面臨的挑戰, 并展望了未來納米孔測序技術的發展前景。  
DNA 測序技術作為人類探索生命秘密的重要手段之一, 對生物、生命科學、醫學等領域的技術發展起到了巨大的推動作用. 自從誕生以來, DNA測序技術的發展經歷了幾代技術的變革. 第一代技術使用的是1977年Sanger等人發明的鏈終止法或Maxam和 Gilbert發明的鏈降解法, 因為其超高精度并可以從頭測序、從頭組裝的特點, 以此為基礎的毛細管電泳測序方法在特定領域仍有著不可取代的作用. 

第二代技術作為目前市場上主流的 DNA 測序技術, 較第一代測序技術而言, 測量通量明顯提高. 如Roche454 公司的 GS FLX 基因測序系統, Illumina 公司的 HiSeq/MiSeq/Genome Analyser 系統, Life Technologies 公司的 5500xl SOLiD 系統. 此外, 被稱為第2.5代的Helicos公司的HeliScope系統在第二代測序技術的基礎上引入了單分子測序的概念, 在速度和成本方面較之前有了一定進步. 

第三代技術以Pacific Biosciences 公司的 RS 系統為代表, 以單分子實時測序為主要特點, 對零模波導中的單個熒光分子進行高靈敏度檢測, 從而快速獲得 DNA序列信息. 

納米孔測序技術屬于第四代測序技術, 其通過物理方法, 無需生物化學預處理而直接對 DNA 序列進行讀取, 正向著高通量、高讀長、低成本、小型化的方向發展.
納米孔測序技術原理  
納米孔測序方法不同于其他測序方法, 不需要對 DNA 進行生物或化學處理, 而采用物理辦法直接讀出 DNA 序列. 其原理可以簡單的描述為: 單個堿基通過納米尺度的通道時, 會引起通道電學性質的變化. 理論上, A, C, G, T 4 種不同的堿基化學性質的差異會導致它們穿越納米孔時引起的電學參數的變化量也不同, 對這些變化進行檢測可以得到相應堿基的類型.
目前用于DNA測序的納米孔可以大致分為2類生物納米孔和固態納米孔. 由于 DNA 鏈的直徑非常小(雙鏈 DNA 直徑約為 2 nm, 單鏈 DNA 直徑約為1 nm), 所以對所采用的納米孔的尺寸有著近乎苛刻的要求. 生物納米孔多采用的是α溶血素(一般嵌入在雙層脂膜當中), 其最窄處直徑尺寸約為 1.5 nm,恰好允許單鏈 DNA 分子通過, 并且大小嚴格一致。  
然而生物納米孔在膜穩定性、 電流噪聲等方面的問題在一定程度上限制了其發展. 牛津納米孔公司在蛋白納米孔的應用方面取得了一定進展, 他們的GridION和MinION系統就是基于蛋白納米孔的測序平臺. 固態納米孔主要是利用硅及其衍生物制造而成, 一般使用離子束或電子束在硅或其他材料薄膜表面鉆出納米尺度的孔洞, 再進一步對孔的形狀和大小進行修飾而成.
相比于生物納米孔, 固態納米孔在穩定性、電流噪聲、工藝集成方面有著顯著的優勢, 但是因為受限于如今的半導體工藝制造水平, 固態納米孔的制造還較為復雜與昂貴.   
固態納米孔工藝 

固態納米孔的制作與半導體工藝的結合使得DNA測序芯片的大規模生產成為可能. 2001年, Li等人使用聚焦離子束在 Si3N4 薄膜上制作出了直徑61 nm 的孔, 隨后又采用 Ar將孔徑縮小到了 1.8 nm.2003年, Storm等人用高能電子束在SiO2薄膜上制作出了直徑 2 nm 的孔. 如今, 人們已經可以在很多材料上制作出亞 10 納米尺度的固態納米孔, 例如,SiNx, SiO2,SiC, Al2O3等. 此外, 石墨烯因其本身超薄的結構和特殊的電子特性也作為薄膜材料的一種新選擇, 它的超薄的單原子層結構十分適合隧道電流的測量. 納米電極制作  納米電極的制作在測序用納米孔制造工藝中也是一項重要的挑戰. 前文提到, 納米電極的形狀、與納米孔重合度的好壞直接影響到電流信號的好壞, 因此要在納米尺度制作出形狀規則、 電學特性良好的電極并不容易.  
目前研究者們所做的工作都是在實驗室中對單個納米孔進行研究, 而無法將其運用到商業中. 到目前為止, 還沒有辦法能夠快速制作出直徑大小均一且都在5 nm以下的納米孔陣列, 在DNA測序芯片向商業化轉變的道路上, 這是必須解決的一個問題. 但是, 相信隨著半導體制造工藝和納米電子學的不斷發展, 人們一定會制作出高質量的納米孔芯片.
面臨挑戰與發展前景  雖然納米孔測序的優點十分明顯, 與前幾代技術相比在成本、速度方面有著很大優勢, 但是目前還處在起步階段, 從測序原理到制造工藝都存在有許多問題, 許多技術也都只停留在理論階段. 這篇文章列舉了目前納米孔測序技術中遇到的一系列挑戰以及研究者們針對這些挑戰提出的解決辦法. 原文摘要：
陳文輝, 羅軍, 趙超. 固態納米孔: 下一代DNA測序技術—原理、工藝與挑戰. 中國科學: 生命科學, 2014, 44: 649–662
Chen W H, Luo J, Zhao C. Solid-state nanopore: the next-generation sequencing technology—principles, fabrication and challenges. SCIENTIA SINICA 
Vitae, 2014, 44: 649–662, doi: 10.1360/N052014-00091